附件 10.30

研究协议

（非临床）

本协议（“协议”）于2022年7月1日（“生效日期”）由迈阿密大学（“大学”）和Jupiter Neurosciences签订，Inc.（“公司”）进行一项题为：帕金森病模型中JOTROL的评估（“研究”）的研究，如作为附件 A所附的协议/工作范围中所述，并成为其中的一部分。

1.首席研究员。

大学的首席研究员应为Shaun Brothers。公司的技术总监应为Alison D. Silva。

2.资金数额。

开展这项研究的资金数额为72,844.00美元（附件 B）。该金额的百分之一（100%）将由公司支付给大学。执行本协议时支付24,000美元，在动物中首次给药JOTROL时支付24,000美元，剩余金额在完成最终研究结果报告后支付24,844美元。对原始协议的修改必须在执行时全额（100%）支付。

预计赠款资金将按照所附预算总体支出。实际支出可能由大学自行决定。研究完成后，任何未动用的资金将由大学保留。

3.报告要求（如有）。

完成并收到最终付款后，将向本公司发送研究报告。

4.协议期限。

本协议的履行应从生效日期开始，并应持续一（1）年，除非根据本协议提前终止。公司或大学均可出于任何原因在三十（30）天书面通知后终止本协议。

如果发生此类终止，公司和大学均应采取一切合理措施取消与本协议有关的进一步费用。公司和大学将有权获得在终止生效日之前发生的费用和不可取消义务的补偿，除非此类补偿在任何情况下都不得超过第2节规定的总金额。

5.机密信息。

双方可以相互披露与研究有关的某些机密和专有信息和材料，或其他技术、业务或其他性质的专有信息，以促进、支持和/或进行研究。双方交换的所有机密和专有信息均构成“机密信息”。”

各方同意，在本协议终止或期满后的五（5）年内，其应对另一方的机密信息保密，并将防止向第三方披露此类机密信息。此类限制不适用于以下机密信息：

6.出版权。

大学应享有与研究相关的出版特权。公司同意大学的首席研究员应被允许在期刊、论文、论文或他们自己选择的其他形式上发表，并在座谈会和国家或地区专业会议上介绍研究的方法和结果，主题到以下。在向期刊、编辑或其他第三方提交此类拟议出版物或演示文稿之前至少三十（30）天，大学应向公司提供拟议出版物、摘要、论文、论文或演示文稿的副本。此类事先提交的目的是：（i）为公司提供审查和评论拟议出版物或演示文稿内容的机会；确定要从拟议出版物或演示文稿中删除的任何机密信息（不包括研究数据和结果）；留出时间为任何 待确定的可专利主题。公司应在收到拟议的出版物或演示文稿后三十（30）天内向大学提供任何意见。大学应适当考虑公司提出的任何意见，但大学没有义务将公司的意见纳入出版物。大学特此同意从拟议出版物中删除公司要求大学删除的任何机密信息，但仅限于此类删除不排除对研究结果的完整和准确呈现和解释的范围内。公司应在收到提议的出版物或演示文稿后三十（30）天内以存在需要保护的可专利主题为由反对提议的出版物或演示文稿。如果公司提出此类反对意见，大学应在不超过六十（60）天的时间内避免发表此类出版物或演示文稿 自收到此类反对之日起（除非经双方书面协议延长），以便提交针对拟议出版物或演示文稿中包含的可专利主题的专利申请。

在与研究有关的任何出版物中，大学应承认公司的贡献在科学上是适当的。

大学应向公司提供本研究得出的所有数据。

7.知识产权。

截至本协议生效日期存在的发明、发现、作者作品和其他发展的所有权，以及其中的所有专利、版权、机密信息、商业秘密权和其他知识产权（统称为“现有知识产权”），不受本协议的影响，任何一方均不得对另一方的任何先前存在的知识产权提出任何索赔或权利，除非他们之间的任何其他书面协议另有明确规定。

公司根据进行研究而构思或实施的任何发明或发现的所有权应属于公司（“公司发明”）。大学构思或实施的任何发明或发现的所有权与研究相关或由此产生的，或大学根据公司为进行研究而提供的材料所做的任何改进，应由公司和大学共同拥有（“联合发明”）。大学根据进行研究而构思或付诸实践的任何其他发明或发现的所有权应属于大学（“大学发明”）。大学应始终保留非排他性的全球免版税许可，以使用公司发明和公司在联合发明中的权益进行研究，用于其内部教育、非商业研究和患者护理目的，并遵守任何适用的法律和法规。

8.保障。

每一方应全权负责支付因其雇员或代理人在履行本协议项下的义务时的任何作为或不作为而引起的任何和所有损失、人身伤害、死亡、财产损失或其他索赔。每一方同意赔偿另一方并使另一方免受任何和所有索赔、损失、损害、成本、费用、诉讼、因另一方（“被赔偿方”）的任何作为或不作为引起或与之相关的诉讼和判决，包括律师和专家的费用以及通过上诉级别（“赔偿方”）对另一方（“被赔偿方”）提出或招致的费用赔偿方、其代理人和雇员。

本款和第8款的规定在本协议终止后继续有效。

9.保险。

公司同意自费购买并保持一般责任保险，每次事故限额不低于1,000，000美元，总额不低于2,000，000美元，以涵盖因任何人的身体或人身伤害或死亡或财产损失而造成的损害赔偿责任。

在签署本协议之前，公司应提供保险证明或自我保险函（如果公司是自我保险的），说明承保范围。

10.大学员工

除非大学另有书面批准，否则只有大学员工才能参加本研究的任何专业和技术活动。公司同意免除大学及其代理人和员工遭受的任何和所有损失、索赔或损害，包括人身伤害或死亡或财产损失，包括上诉级别的律师费，并使大学免受损害和赔偿在大学校园内，由公司、其代理人和员工的任何作为或不作为引起或与之相关，前提是此类损失、索赔或损害不是由大学的疏忽引起的。

11.名称的使用。

公司同意在任何情况下都不会在广告、新闻稿、宣传或其他书面或口头公告中使用大学或任何教职员工的名称，无论是向公众媒体还是其他方式，未经大学商业服务助理Vice President Humberto Speziani的明确书面许可。大学应在科学出版物和其他科学传播中承认公司对本协议项下研究计划的支持。

12.材料。

为与研究相关而获得的所有设备和材料将在协议终止时归大学所有。除非本协议另有规定，公司向大学提供的任何设备的所有权应在交付给大学时转移给大学。根据迈阿密大学的政策，研究人员开发或发现的与公司技术不直接相关的任何检测、序列、克隆、突变体或技术均属于研究人员的财产。

13.保证。

大学不作任何明示或暗示的保证，并在此否认对任何事项的所有此类保证，包括但不限于研究或任何发明或产品的状况，无论是有形的还是无形的、构思的、发现的，或根据本协议开发；或所有权、适销性、或适用于研究或任何此类发明或产品的特定目的。对于任何被许可人或任何第三方因使用研究或任何此类发明或产品而遭受的任何直接、后果性或其他损害，大学概不负责。

本款的规定应在本协议终止后继续有效。

14.联邦法规。

不得根据本协议进行人体受试者测试。任何涉及使用脊椎动物的研究都应遵守所有管理动物护理和使用的州和联邦法规、规则和条例。任何涉及同位素的研究都必须遵守任何和所有适用的州和联邦规则、法规和法规。重组DNA研究应按照作为涉及重组DNA分子的研究指南颁布的法规进行，美国卫生与公众服务部、公共卫生服务部、美国国立卫生研究院。

15.冲突。

如果与本协议的条款、协议/工作范围或与本研究有关的任何其他文件发生冲突，则以本协议的条款为准。

16.适用法律。

本协议受佛罗里达州法律管辖。

17.通知。

任何一方根据本协议需要向另一方发出的所有通知均应采用书面形式，并应通过挂号信、要求回执或亲自递送的方式发出，或通过快递或联邦快递（或类似的隔夜快递）发送给该另一方，或通过传真（通过此处接受的任何其他方法进行确认）。通过挂号信发出的任何通知应被视为在邮寄之日起三（3）天后收到。如果是专人递送或通过当日快递或隔夜快递或传真递送，则该通知应在递送至被通知方之日视为已收到。所有通知均应发送至以下指定地址：

18.整个协议。

没有关于本协议标的的口头协议未在此处完整表达。除此处明确规定的内容外，在制定本协议时未作出或依赖任何陈述、理解或协议。本协议只能通过双方正式授权代表签署的书面文件进行修改。

[页面的剩余部分故意留空]

兹证明，双方已由其正式授权的官员于本协议第一次规定的日期签署本协议：

附件 A

协议/工作范围

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Jotrol的评估

在帕金森病模型中

肖恩兄弟，博士，工商管理硕士

Candace H. Carriere博士

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提案概述

此处提出的研究旨在首先验证Jotrol作为治疗帕金森病的临床前候选药物。其次，确定与目前可用的治疗方案相比，该药物代表了最佳候选药物。验证同一药物系列中的其他候选药物，例如未配制的白藜芦醇和piceatannol的反应和疗效。开始研究该化合物减轻运动功能障碍的作用机制。验证该药物在动物和PD动物模型中的作用机制。确定JOTROL的高血药浓度是否会有意义地实现，以及这如何转化为其在这种疾病状态下的治疗效果，类似于其与阿尔茨海默病和MPSI等其他神经系统疾病的潜在临床相关性。最后，我们的目标是开始进行人体实验和临床试验所必需的数据收集过程。特别是为此， 实验方法是在验证当前PD临床候选药物具有人类治疗潜力的相同方式的基础上建模的。

项目目标

总体目标：在小鼠帕金森病的经典毒素模型中评估Jotrol活性。

目的1：应用运动行为试验验证JOTROL在单侧颅内MPTP模型中的保护作用。

目的2：验证JOTROL对SN多巴胺能神经元及纹状体多巴胺含量的保护作用。

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拟议的项目时间表

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背景

帕金森病，仅次于阿尔茨海默病的第二大最常见的年龄相关性神经退行性疾病^1,2其特征是直接运动通路的黑质紧致区内产生多巴胺的神经元丢失，进而导致纹状体内突触后多巴胺耗竭。多巴胺功能的这种丧失会导致运动行为缺陷，包括无法控制的震颤、姿势失衡、僵硬和运动缓慢³.运动症状的严重程度是由于SN中酪氨酸羟化酶阳性多巴胺能神经元的丢失⁴.目前，可用的PD治疗选择仅针对症状，主要包括左旋多巴的多巴胺替代疗法^5–9.左旋多巴于1960年代后期被批准用于治疗PD，是最广泛使用的PD处方药^10,11.由于左旋多巴/卡比多巴治疗仅有助于控制PD的运动症状，并不能预防或减缓疾病进展，因此深入了解特发性PD的发病和进展非常重要。

尽管存在与疾病发展相关的遗传和环境因素，但PD的具体病因仍未知。已确定几种致病的单基因突变^12–14.然而，只有一小部分病例（~10%）是遗传基因突变的结果¹.其余病例（约90%）是散发性或特发性的，尽管有证据表明氰化物、痕量金属、有机溶剂和接触农药等外源性毒素会增加发生PD的风险^15–19.流行病学研究表明，环境农药暴露与人类帕金森病发病率增加之间存在密切联系^20–26.事实上，特发性PD和潜在的表观遗传变化长期以来一直使用神经毒素建模，包括6-羟多巴胺（6-OHDA）和1-甲基-4-苯基-1,2，3,6-四氢吡啶，它们都靶向多巴胺能神经元并导致帕金森病综合征。

存在几种产生不可逆行为和分子效应的动物模型，例如在这种疾病中观察到的那些。最广泛研究的PD动物模型使用6-羟基多巴胺（6-OHDA）。6-OHDA是天然存在的神经递质多巴胺的羟化类似物，对多巴胺转运蛋白具有高亲和力，是第一个用于研究PD的模型²⁷.6-OHDA无法穿过血脑屏障，因此需要局部注射才能获得所需的效果^28,29.当6-OHDA被注射到黑质或内侧前脑束中时，它选择性地积累在多巴胺神经元中，导致顺行变性和细胞死亡³⁰.当6-OHDA注入纹状体时，黑质纹状体通路的逆行退化也会发生，导致纹状体多巴胺和SN多巴胺能神经元的大量丧失^31,32.由于多巴胺耗尽，单侧输注6-OHDA也会产生相当大的运动缺陷，其程度可以通过评估苯丙胺或阿扑吗啡给药后的旋转行为来评估^28,33.不幸的是，6-OHDA不会诱发PD的所有病理特征，因为α-突触核蛋白病和路易体的形成不会发生^27,34.

线粒体与帕金森病之间的联系最初是在1979年假设的，当时一名大学生试图合成海洛因类似物1-甲基-4-苯基-4-丙氧基哌啶，但意外地用1-甲基-4-苯基-1,2，3,6-四氢吡啶污染了药物-1,2，3,6-四氢吡啶，因此当他自行给药时，他开始出现帕金森病样症状²⁵.1982年再次观察到这种影响，当时一群年轻的非法吸毒者在静脉注射被MPTP污染的MPP后出现非常严重的帕金森病症状^1,35.研究表明，MPTP可以很容易地穿过血脑屏障，在那里它被单胺氧化酶B氧化成1-甲基-4-苯基吡啶³⁶.由于其结构与多巴胺相似，MPP +被多巴胺转运蛋白吸收，导致抑制电子转运链的复合物I（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）-泛醌氧化还原酶）活性，并最终导致细胞死亡^30,37.此外，动物研究表明

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MPTP和其他线粒体功能抑制剂，如农药鱼藤酮，产生许多在帕金森病中观察到的相同特征，包括行为缺陷、黑质纹状体变性和蛋白质聚集^38–45.

MPTP具有高亲脂性，可穿过血脑屏障，在单胺氧化酶B的催化下，在胶质细胞和5-羟色胺能神经元中被氧化为1-甲基-4-苯基-2,3-二氢吡啶⁴⁶.MPDP +非常不稳定，会自发氧化为MPP +。然后MPP +被释放到细胞外空间并通过多巴胺转运蛋白吸收，在那里它靶向线粒体并抑制电子转运链的复合物I活性。这导致三磷酸腺苷的产生减少，同时增加活性氧的产生，导致神经元细胞死亡^27,30.MPTP是这种疾病最常用的动物模型之一，因为施用这种毒素会导致沿黑质纹状体途径的运动症状和多巴胺能恶化，这与在帕金森病中观察到的非常相似⁴⁷.与该技术相关的缺点包括其他单胺能神经元（例如位于蓝斑的神经元）的损失不一致，以及缺乏路易体形成³⁴.

由于目前对该疾病的了解水平，只有当个体附件功能障碍的运动症状时，才会诊断出PD患者，表明患有这种疾病的人已经失去了至少50%的SN中的多巴胺能神经元群体，并且他们的纹状体中多巴胺能含量高达或超过80%⁴⁸.因此，预防PD发作或减缓进展速度的预防性疗法或策略对于PD的治疗是必要的，但目前尚无此类干预措施。如前所述，目前可用的治疗选择仅针对运动或非运动症状管理，主要包括使用标志性多巴胺替代疗法左旋多巴。左旋多巴于1960年代后期被批准用于治疗PD，是最广泛使用的PD处方药^10,11.左旋多巴被肠道吸收，穿过血脑屏障，在大脑中转化为多巴胺。它通常与卡比多巴或儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂联合使用，可在左旋多巴到达大脑之前防止其分解，延长左旋多巴的作用持续时间并限制其副作用。用左旋多巴/卡比多巴或COMT抑制剂治疗可以在整个疾病过程中有效，但由于PD的美国前进保险性质，随着时间的推移可能需要增加药物剂量以帮助控制症状^49,50.运动并发症在慢性左旋多巴治疗中非常常见，多达50%的患者在2-5年内出现某种形式的运动功能障碍，80-100 %的患者在治疗10年后报告症状。这些运动症状主要表现为运动障碍（不自主运动）和/或运动波动的发展，其中症状无法控制并且会逐渐出现（左旋多巴效应在下一次给药前消退）或突然且不可预测地出现^51–53.

除了使用备受推崇的左旋多巴/卡比多巴组合进行运动症状管理之外，PD患者还可以接受其他常见的运动障碍治疗，其中包括：多巴胺激动剂（模拟多巴胺在大脑中的作用，可以单独使用或与其他PD药物，包括左旋多巴，并且与左旋多巴相比，不太可能导致负面的运动副作用，但在控制运动缺陷方面也不太有效）、单胺氧化酶B抑制剂（通过降低酶的活性来防止大脑中多巴胺的分解单胺氧化酶，可以单独使用或与其他治疗联合使用，并在PD的早期病例中提供轻微的症状益处，希望延迟或避免使用多巴胺能治疗），抗胆碱能药物（PD中乙酰胆碱水平升高，这些治疗恢复了这种神经递质和多巴胺之间的平衡，多巴胺有助于控制震颤，有时 肌张力障碍）和金刚烷胺药物（作用于多巴胺和谷氨酸神经递质系统，用于治疗运动障碍和轻度PD症状）。对于一些运动波动控制不佳的患者，另一种治疗选择是深部脑刺激，将电线植入目标基底节区域并使用远程设备进行刺激。深部脑刺激的使用已被证明可有效减轻运动症状并改善整体生活质量，尽管该手术存在潜在的负面副作用，包括言语和认知障碍、步态改变、神经精神后遗症以及手术风险 ^54–60.除了与PD相关的运动问题外，还有非运动症状，这可能是疾病本身或用于治疗该疾病的药物造成的。此类非运动并发症包括便秘、痴呆、抑郁或焦虑、流口水、疲劳、体位性低血压、疼痛（与疾病直接相关、肌张力障碍或运动迟缓引起的肌肉疼痛，或平衡或行走问题导致的跌倒损伤）、精神病（幻觉或妄想）、性功能障碍、睡眠障碍、和可能导致尿失禁的泌尿系统症状^58,61–63.目前缺乏可用于PD患者减缓或阻止进展速度的可用疗法是贬低的，并且是治疗PD所必需的，但目前尚无此类干预措施，因此敦促需要更好的治疗选择。

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筛选了几个小分子文库，以保护经6-OHDA或MPTP处理的分化SH-SY5Y（多巴胺能神经元，使用多巴胺标志物验证）。发现了几种命中化合物，经过验证，有几种出色的命中，但最有趣的是白藜芦醇。反式白藜芦醇是一种天然存在于红酒、蓝莓和许多其他水果和豆类中的植物化学物质。在探索临床疗效的研究中，已经证明白藜芦醇由于其低生物利用度而必须以高剂量给药。在一项随机双盲II期临床试验中，阿尔茨海默病合作研究组证明，每天向AD患者施用多达2克白藜芦醇可稳定脑脊液和血浆中A β 40和A β 42的积累⁶⁴.这项为期12个月的试验从每天500毫克的剂量开始，每3个月增加500毫克，最高可达1克B.I.D.本研究中的初始剂量可能不足，由于白藜芦醇治疗仅6至12个月后就获得了积极效果；群体药代动力学评估表明，即使在稳态下的最高给药剂量，在CMAX下也仅达到约200 ng/mL的血浆白藜芦醇。文献报道详细说明了由于首过代谢导致白藜芦醇的生物利用度低⁶⁵.为了进行这项研究，研究人员确定需要显着更高的生物利用度或口服白藜芦醇才能安全地获得治疗益处。在为期12个月的AD白藜芦醇研究中，副作用包括体重减轻和胃肠道问题，如与高剂量相关的恶心和腹泻。从药效学的角度来看，只有高剂量的白藜芦醇才能获得治疗益处；重要的是，一些研究提供了人群PK数据。在弗里德赖希共济失调中，一种罕见的遗传疾病，由于线粒体功能障碍导致进行性神经系统退化和运动缺陷，使用5克（！）白藜芦醇/天实现了积极的临床（神经系统）结果⁶⁶.血浆CMAX水平低于200 ng/mL没有显示出益处。此外，健康个体中5克白藜芦醇的平均峰值血浆CMAX为539 ± 384 ng/mL，约为2.4µ mol/L，这不足以引起任何有益的生物学效应，因为在体外观察到白藜芦醇在生物学水平的活性为10-100 µ mol/L^67–69.对于我们的目的而言，重要的是，与载体相比，白藜芦醇在体外试验中通过3个标准偏差保护存在鱼藤酮的多巴胺能神经元细胞死亡。

Trans-Piceatannol是白藜芦醇的衍生物，已发现两者均有益于粘多糖贮积症I，一种常染色体隐性遗传疾病，其中α-L-艾杜糖苷酶在受影响个体中大量耗尽或缺失，导致糖胺聚糖肝素和硫酸盐皮肤素GAG的积累。这些多糖糖在溶酶体中的积累会导致细胞破坏、炎症、认知能力下降等。最终发生器官衰竭，然后死亡⁷⁰.尽管白藜芦醇的效力比白藜芦醇低约10倍，但白藜芦醇和白藜芦醇已通过上调IDUA酶活性证明了治疗潜力。虽然对人体皮西他诺知之甚少，但白藜芦醇已在人体中得到广泛研究，至少有49项临床试验已在成人中完成或正在进行中。迄今为止，显然尚未进行piceatannol的临床试验。显然没有在儿童中进行白藜芦醇的临床试验。

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白藜芦醇对人类给药似乎非常安全。白藜芦醇可从例如GNC等来源的柜台上获得。白藜芦醇的可用配方包括500毫克胶囊、15毫克/毫升DMSO注射溶液、口服溶液和舌下胶囊，尽管其中一些可能不是来自可信赖的来源或具有经过验证的药物含量。显然还有一种透皮贴剂，可能来自不受信任的来源，目前尚不清楚白藜芦醇的时滞、稳态血浆水平、最大暴露量和皮肤渗透性是什么，因此透皮给药最不利于达到高血/脑浓度的白藜芦醇。注射形式的初始浓度似乎也很低。对于每天一次给药，这种途径也被认为是次优的。舌下给药显然有利于规避肝脏首过代谢，但尚不清楚白藜芦醇是否进入 血流速度足够快，以达到高AUC和CMAX。轶事证据还表明，舌下给药需要将药物保持在舌下30分钟或更长时间。每天给药两次或三次可能会出现问题，因此预计依从性会很低。因此，口服给药被认为是白藜芦醇给药的最佳途径。然而，肝脏的首过代谢会降低药物的总停留时间和血流中的最大浓度（CMAX；两者都是衡量身体吸收药物和保持药物的程度的指标，在这种情况下，这些越高越好）。由于白藜芦醇显示出与PD治疗相关的无数特性，并在临床前研究中显示出高剂量的潜在效用，因此明确的问题变成了如何以耐受性良好的高度生物可利用的形式提供白藜芦醇。我们评估了几种先进的给药方法来解决 这个问题。然而，经皮或经颊给药是不可行的，所需的高血液水平加上快速代谢使输注或注射途径不切实际。

白藜芦醇不溶于水，在肠道吸收后通过肝脏首过代谢迅速降解⁶⁵.在摄入之前对白藜芦醇进行微粉化可以提高生物利用度，并且添加成分，例如乳剂或脂质体，可能会提供一些好处。白藜芦醇的理化性质表明，如果它可以作为脂质类营养素呈现，则其吸收和生物利用度将得到改善。脂质进入淋巴并避免肝脏代谢先通。当白藜芦醇在亲脂相中溶解并在乳液中以液滴形式稳定在水环境中时，白藜芦醇可以保留在脂质体的磷脂层中。与天然形式相比，这可以增加生物利用度，但这种类型的制剂，如脂质体，极不稳定，对胃环境没有抵抗力。

因此，我们开发了一种新型的白藜芦醇口服制剂（称为JOTROL），其PK特性明显优于当前最佳版本的白藜芦醇（微粉化）。Jotrol是一种稳定的胶束制剂，用于口服给药，用作医药产品研究所，其中提高了白藜芦醇的生物利用度并避免了首过代谢（该制剂已获得欧洲专利保护EP3468535）。Jotrol提供一种独特的增溶产品，由白藜芦醇、聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20的混合物以及至少一种中链甘油三酯和生育酚组成。Jotrol的结构是胶束，大小约为30nm，类似于自然形成的生理混合胶束的结构，其核心含有水不溶性化合物，被双亲分子包围。通过产品粉碎获得更高的生物利用度，是基于该运输系统的独立性 从生理混合胶束形成的限制参数。重视产品胶束特性作为“封装和传输介质”非常重要。白藜芦醇胶束制剂使血浆峰值水平比未配制的白藜芦醇提高至少10倍。我们的初步数据表明，JOTROL在啮齿动物大脑中具有药理活性。一项试验性人体接触试验显示了类似的结果。重要的是，减少身体负担也有望减少副作用。此外，Jotrol已被批准用于MPSI的临床试验，以期将其用于其他神经系统疾病，如弗里德赖希共济失调和阿尔茨海默病，证明其在一系列神经系统疾病进入临床阶段的潜在效用。

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实验方法

目标：在帕金森病毒素模型中评估白藜芦醇和Jotrol活性

目的1：应用运动行为试验验证JOTROL在单侧颅内MPTP模型中的保护作用。

未配制的白藜芦醇和JOTROL的活性将在PD和假灌注C57/BL6小鼠的颅内MPTP模型中得到验证，该方法已根据目前处于其他药物II期临床试验的工作直接建模^71–74.在这个里程碑中，我们将努力验证JOTROL对一般健康和运动行为的整体神经保护能力。首先，将使用载体（假灌注对照）或MPTP使用立体定向手术将这些损伤微注入动物，以将这些损伤传递到黑质紧致区和黑质纹状体通路的内侧前脑束。预计动物将在24小时内康复，并在手术后7-10天取下伤口夹子。手术后，动物将接受功能观察组，这是一种无创全身神经系统检查，以检测暴露于化学品后的总体功能缺陷。对动物的观察将从它们在笼子里的一般行为开始，然后在野外测试中测量动物的一般运动。行为将被排名（存在/不存在，或按比例），包括身体姿势、活动、运动协调、呼吸率、流泪、 鬼脸、纠正反应、唤醒、易于移除、处理反应、体重、排尿/排便以及存在刻板印象或自残 ⁷⁵.对于露天测试，动物将在黑暗阶段被放置在PVC装置中，并将有5分钟的时间进行探索，并有5分钟的时间进行测试。在测试期间，将测量运动、外部/内部区域的占用和饲养。体重测量将继续每天监测动物的健康（图1）。

一旦确定了动物的总体健康状况（未达到终点），我们将开始在几种不同的运动和认知行为测试中评估动物的功能能力，包括：

空旷的领域。小鼠的自发活动将在旷野中检查15分钟（适应5分钟，测试10分钟）。水平（运动）和垂直活动（饲养）都由固定在天花板上的高架高清录像机监控，并且将使用EthoVision软件（无偏见）评估行为^40,41,76.在测试期间，将测量总运动、外部/内部区域的占用率、壁爬升和饲养，这些动物注入毒素最有可能表现出饲养缺陷、壁爬升增加和靠近壁的外部区域的时间。那些接受JOTROL治疗的人预计会表现出与注入载体（假）一样的活动，从而消除这种功能失调的运动行为。

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握力。动物被放置在由12毫米正方形的1毫米直径铁丝组成的铁丝网筛网的中心。屏幕旋转到在变暗的衬垫表面上方40厘米处倒置的位置（因此动物无法看到地面）。将记录从动物到达倒置位置到小鼠脱落或由于达到180秒的标准时间而将动物移除的时间，并使用三个试验的平均值进行分析（图2）⁷⁷.注入毒素的动物预计会表现出握力降低。我们预计Jotrol将改善PD模型中出现的握力不足。

旋转木马。小鼠以4 rpm的速度放置在杆上，然后从4到40 rpm加速超过30秒。记录最大速度和下降延迟。动物被测试两次，每次试验之间大约30分钟，使用平均值（图3）⁷⁸.注入毒素的动物在测试过程中预计会表现出较差的时间和速度，但是用Jotrol成功治疗应该可以消除任何运动问题。

左旋多巴反应行为。每只动物将通过在使用左旋多巴（20 mg/kg，I.P.）前20分钟、手术后3周、然后在整个过程中每3周注射一次卡比多巴（2 mg/kg，I.P.）来测试对左旋多巴的反应研究。在接受左旋多巴注射后30至120分钟（在左旋多巴的治疗窗口内），将如上所述进行旋转棒活性⁸⁸).为了评估运动活动和前肢不对称性，将动物放置在开阔场地装置中10分钟以达到基线活动水平。然后动物在施用左旋多巴（20 mg/kg，i.p.）之前20分钟接受卡比多巴（2 mg/kg，i.p.），然后返回同一装置再进行120分钟。左旋多巴有望暂时将注入毒素的小鼠的运动功能恢复到接近正常水平，因此JOTROL治疗预计不会发生变化或任何其他改善。

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旋转诱导的行为。手术后两周，动物将注射甲基苯丙胺（5 mg/kg，即P；我们持有必要的DEA执照，目前室内有甲基苯丙胺）并记录在与露天试验相同的PVC装置中。在记录对侧和同侧旋转90分钟之前，小鼠将在环境中栖息10分钟（图4）^29,82.该测试将不超过每两周进行一次，以减少对药物的脱敏。我们预计Jotrol治疗将减少因甲基苯丙胺而旋转的次数（假注射动物预计不会旋转）。

需要注意的是，所有测试都将在小鼠的觉醒周期（夜间，黑暗阶段）进行，并且实验者将对治疗条件不知情。

可能需要高血浆浓度，因此我们将努力确保大量JOTROL。因此，这可能需要由化学实验室合成，如果是这样，则总体质量必须高，预计纯度大于99.5%。

通过减轻单侧输注MPTP导致的运动缺陷和神经功能障碍，每日JOTROL治疗的读数预计将对行为分析产生积极影响。由此产生的行为效应将提供对参与控制PD病理生理学中涉及的关键机制的潜在机制的基本洞察，并提供有关哪些神经分子通路相关的关键知识。

目的2：验证JOTROL对SN多巴胺能神经元及纹状体多巴胺含量的保护作用。

JOTROL的神经保护功效将通过评估PD单侧MPTP模型和接受载体或JOTROL治疗的对照动物中任何改变的电路模式来确定。在这个子里程碑中，将评估动物沿黑质纹状体途径的多巴胺能完整性和纹状体中的多巴胺含量。这将进行如下：

离体脑组织多巴胺和GABA能标志物和细胞群的蛋白质提取和western blot分析。动物将被麻醉并迅速断头以快速收集大脑。大脑解剖将在冰上的无菌培养皿上进行，以获取中脑和纹状体组织的独立半球。回收的样品将储存在-80 ° C直至测试。样品将使用哺乳动物蛋白质提取试剂进行漂洗和裂解，并辅以HALT蛋白酶抑制剂混合物。样品将被冷冻至少6小时并解冻以促进裂解，并且样品也将被超声处理。然后将样品以14,000 x g离心10分钟。上清液将转移到新管中，并且将使用Envision平板阅读器进行和测量双胞嘧啶酸测定以量化蛋白质。

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对于Western Blots，将使用Criterion Blotter Western Blot系统。在95-100 ° C下，在Laemmli样品缓冲液中将30 UG的总蛋白质煮沸10分钟。样品将装入10%的凝胶中，电泳设置为60-100V。凝胶中的蛋白质将通过100V的湿式转移转移到PVDF膜上30分钟。膜将在室温下在5%牛奶中阻塞1小时，在4 ° C下在5% BSA中用初级抗体探测过夜，在室温下在5% BSA中用次级抗体探测1小时。印迹将通过C位印迹扫描仪进行可视化，图像将使用ImageJ进行量化。多巴胺能和GABA能人群的主要抗体和标志物将被使用，包括抗TH、抗DAT、抗NEUN、抗巴伐清蛋白、抗生长抑素、抗多巴胺受体1、抗多巴胺受体2和β-肌动蛋白（对照））。每个初级的二级抗体将用于可视化这些蛋白质（图。 6) ⁴⁰.

HPLC分析。为了评估纹状体中的多巴胺和GABA含量，我们将再次评估如上所述收集的新鲜组织样本。纹状体组织将在0.5 M高氯酸中裂解。多巴胺和GABA的水平将使用带有ECD检测器和反相柱的反相ULTIMATE 3000 HPLC系统进行测量，并在Chromeleon ™ 7.2色谱数据系统的控制下进行分析。流动相为1.3% NAAC、0.5%庚磺酸钠、0.01% EDTA（用100%乙酸调整为pH4.0）、2%甲醇和7%乙腈的混合物。所有用于HPLC分析的溶液将在使用前通过0.2 µ M膜双重过滤并脱气，流速将设置为1 mL/分钟。

总结

我们在此提出了一项临床试验的启用计划，以评估JOTROL治疗帕金森病的效果。白藜芦醇和JOTROL似乎是安全的，任何积极的结果都将有助于PD临床试验。此处介绍的里程碑伴随着不通过的标准，如果不满足此类标准，与额外里程碑相关的成本将随时停止。

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参考文献

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