图2。Azenosertib是一种选择性WEE1抑制剂，可调节癌细胞系中的WEE1相关通路-10-8-6 000.10.3 100。2 0.5 1 2 0 0.01 0.02 5 0.05 0.1123456789 1011剂量（μ M）剂量（μ M）p-CDK1（Y15）靶点接合CDK1 Cyclin E1 Cyclin B1 pS10-HH3 pS345-CHK1 γ H2AX（S139）裂解caspase-3（D175）Vinculin Lane p-TCTP（S64）TCTP WEE1 p-CDK1（Y15）Vinculin 20406080100120 log [化合物（M）] Azenosertib Azenosertib A-427（肺）BI-2536（PLKi）N或m al iz ed BR ET re sp on se（%）00.10.31 Azenosertib OVCAR3（卵巢）DDR凋亡细胞周期Azenosertib和adavosertib通过基于FRET的Z á I-LYTE测定法（赛默飞世尔）测定。数据提取自Huang et al. J Med Chem。2021.10 B.在HEK293细胞（Promega）中使用PLK1 nanoBRET结合试验的azenosertib和BI-2536的剂量反应结合曲线。C. WEE1用p-CDK1（Y15）定量、PLK1用p-TCTP（S64）定量评价抑制活性。用azenosertib或BI-2536治疗前用100 nM诺考达唑在G2/M期同步MDA-MD-231细胞8小时，剂量反应16小时。使用JESS Simple Western检测蛋白表达™instrument（Bio-Techne）。Lane 1包含异步细胞裂解物。LANES2-11细胞与诺可达唑同步，用DMSO处理，增加azenosertib（LANES2-6）或BI-2536（LANES7-11）的量。D. A-427和OVCAR3细胞用DMSO或增加量的azenosertib（0.1,0.3,1 μ M）处理16小时，并使用ProteinSimple Jess Western印迹系统（Bio-Techne）从细胞裂解物中检测蛋白质。图3。Azenosertib导致DNA损伤和癌细胞中的过早有丝分裂进入0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Fr ac ti on o f c el ls Azenosertib耐药Azenosertib敏感KURAMOCHI MDA-MB-231 NCI-H1048 OVCAR3 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 DMSO Fr ac ti on o f p H H 3 + c el ls Azenosertib DMSO Azenosertib DMSO Azenosertib DMSO KURAMOCHI MDA-MB-231 NCI-H1048 OVCAR3 Azenosertib DMSO Azenosertib DMSO Azenosertib KURAMOCHI MDA-MB-231 NCI-H1048标准化表达γ H 2A x no rm al iz ed e xp re ss io n 54% 37% 52% 31% 25% 11% 46% 35% 2% 9% 1% 24% 1% 24% 24% 2% 21% 28% 34% 23% 32% 22% 29% 23% 15% 20% 13% 22% 42% 43% 23% 21% G1细胞周期期EDU-S S G2/M G1细胞周期期EDU-S G2/M PHH3 − γ H2Ax − PHH3 − γ H2Ax + PHH3 + γ H2Ax − PHH3 + γ H2Ax + A B C D A. azenosertib耐药系Kuramochi（HGSOC）和MDAI-MB-22A的细胞周期细胞仪分析和azenosertib敏感线NCI-H1048（NSCLC）和OVCAR3（HGSOC）联合DMSO或1 μ M azenosertib治疗24小时。细胞周期阶段（G1、S、G2/M）和复制状态（EDU-S）在细胞系和处理条件上的百分比分布用彩色条形图表示。B.各细胞系PHH3 +细胞流行率， 根据治疗和细胞周期阶段。C. azenosertib处理过的细胞在4个细胞系（柱）上按PHH3（x丨轴）和γ H2Ax（y丨轴）表达水平分布，并按其细胞周期阶段（行）分布。每个细胞PHH3状态（灰阶）和γ H2AX（蓝阶）都有注明。D.根据γ H2AX状态在两种处理条件（A）中或在不同细胞周期阶段（B）或有丝分裂（C）环境下的azenosertib处理过的细胞中对每个细胞系的细胞分布。图4。Azenosertib表现出广谱抗肿瘤活性多种实体瘤模型的耐受性和耐受性05 1015202530-20-10 01020天治疗后M EA n ↓ BW ± S EM（m m3）05 10152025-20-10 01020天治疗后M EA n ↓ BW ± S EM（m m3）010203040-20-10 01020天治疗后M EA n ↓ BW ± S EM（m m3）05 1015202530-20-10 01020天治疗后M EA n ↓BW ± S EM（mm3）D OS e TP 53 CC N E1 RB 1 PI K3丨CA 丨加利福尼亚州 FB XW 7 KR A S BR A F ST K1 1 ZR − 75 − 1 HCC1806 MDA − MB − 231 T47D MDA − MB − 436 JIMT − 1 HCC1569 MDA − MB − 468 HCC1937 SUM149PT HCC1428 MCF − 7 HT − 29 LS513 COLO 205 SW403 SW620 SW1463 LS411N lovo SW837 SW1116 SK − MES − 1 NCI − H1299 H1975 SW1573 Calu − 6 NCI − H1944 NCI − H358 NCI − H23 PC − 9 Calu − 3 NCI对照）05 10152025300500100015002000250005 101520250100020003000001020304005001000150005 10152025300500100015002000天治疗后M EA n TV ± S EM（m m 3）M EA n TV ± S EM（m m 3）治疗后天数治疗后天数5010050100 Q1 Q2 Q3 Q4蛋白表达（四分位数）Tu m或g ro w th in hi bi ti on（% o f c on tr ol）00 tu m或g ro w th in hi bi ti on（% o f c on tr ol）Q1 Q2 Q3 Q4低高蛋白表达（谱系特异性中值）低高低高p27 _ pT198所有谱系mTOR所有谱系GSK3ALPHABETA _ pS21S9乳腺LKB1肺_ NSCLC SNAIL乳腺SK-UT-1 NCI-H660 SW1116 NCI-H146 40506070501000501000谱系乳腺结直肠肺_ NSCLC肺_ SCLC卵巢胰腺前列腺软_组织子宫60c 60i 80c 80i mut wt扩增缺失NA载体QD azenosertib 80 mg/kg 丨QD A B C A.跨多个适应症的体内疗效。与载体对照（x轴）相比，肿瘤生长抑制的百分比用于54个细胞系异种移植模型，在9个组织学亚型中分离。对于具有可比给药方案的实验，使用跨实验的中值TGI。各条旁注明所选基因的治疗条件（单位：mg/kg i：间歇，c：连续）和突变状态。B. SK-UT-1、NCI-H660、SW116和NCI-H146模型的肿瘤生长曲线显示为接受载体或azenosertib治疗的小鼠随时间的平均TV ± SEM。相应的体重变化如插图所示。黑色虚线在开始治疗时归一化为小鼠体重，红色虚线代表体重损失15%，作为药物耐受性的衡量标准。C. p27 _ T198、mTOR、LKB1/STK11或GSK3 _ alpha _ beta _ pS21 _ S9或SNAIL的体外表达与所有谱系（表达的四分位数）或特定谱系（中位表达）的体内肿瘤生长抑制有关。图5。Azenosertib在与药效学标志物M EA n TV ± S EM（m m 3）相关的A-427肿瘤模型中显示疗效80 m g/kg 40 m g/kg V eh ic le 4 h 8 h 24 h 4 h 8 h 8 h 24 h m ea n ↓ BW ± S EM（m m 3）05 10152025300600900治疗后p-CDK1（Y15）γ H2AX**05 1015202530-20-10 01020天后处理4小时8小时24小时-100-50 050% p-CD K1（Y 15）ch an ge（r el ati ve to ve hi cl e）4 h 8 h 24 h 04008001200% γ H 2A X in du cti on（r el ati ve to ve hi cl e）ns ns ns # # #*******# # # #载体QD 20mg/kg QD 40mg/kg QD 80mg/kg QD载体40mg/kg QD 80mg/kg载a-427肿瘤细胞的NOD/SCID小鼠口服载体治疗的QD A-B C A TGI图或azenosertib口服20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg QD，连续28天。数据显示为平均电视± SEM。采用1向方差分析法计算统计显著性。**P <.01 vs车辆。载体或azenosertib治疗组的平均体重± SEM随时间变化图。红色虚线表示体重减轻15%。B. p-CDK1 Y15（左）和γ H2AX（右）对连续3天载体或azenosertib给药后在指定时间采集的A-427肿瘤的IHC分析。展示了具有代表性的图像。C.表示PD标记、p-CDK1 Y15和γ H2AX定量的条形图。y轴显示H评分相对于载体的百分比变化（由3名独立病理学家评估）。采用2向方差分析法计算统计显著性。**P <.01，***P <.01，ns。#治疗组和载车组对比， P <.05。图6。间歇性给药方案可提高Azenosertib疗效和耐受性M EA n TV ± S EM（m m 3）M EA n TV ± S EM（m m 3）M EA n TV ± S EM（m m 3）γ H 2A X le ve l r el ati ve to ve hi cl e co nt ro l a U C 0-24（μ g*h/m L）C m ax（μ g/g）m ea n TV ± s EM（m m 3）m ea n ↓ bW BW ± s EM（m m 3）m ea n TV ± s EM（m m3）80mg/kg QD 40mg/kg BID 100mg/kg QD 50mg/kg BID 07142128354203006009001200日后处理071421283542-20-10 01020051015202505001000150025005101520250600120018002400510152025300200400600100005101520250500100015002500244872960.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5时间后处理（h）18365472024680天治疗后天数治疗后天数治疗后天数治疗后天数治疗后载体QD 40mg/kg QD 112mg/kg QD,5：256mg/kg QD,5：280mg/kg QD总累积剂量1120mg 1120mg 2240mg 2240mg整车QD 60mg/kg QD 90mg/kg QD,5：280mg/kg QD,5：2总累积剂量1260mg 1200mg 1350mg 90mg/kg QD,4：3 1080mg整车QDTERM10 100mg/kg5：2100mg/kg QDX5 100mg/kg QDX3 50mg/kg BIDX5肿瘤AUC血浆AUC血浆Cmax 100mg/kg QD，连续100mg/kg QD,5：2载体QD，连续A B C D E A-427 OVCAR3A-427 A.携带A-427 NSCLC肿瘤的NOD/SCID小鼠的TGI图（左）以100mg/kg口服QD连续或5：2间歇时间表。时间历程显示停止药物治疗后的电视均值（左）。停止azenosertib治疗后平均体重随时间变化（右）图。B. azenosertib以指定剂量和时间表治疗携带A-427（左）和OVCAR3（右）肿瘤的NOD/SCID小鼠的TGI图。每个实验组在28天期间（A-427）和21天期间（OVCAR3）的总累积药物剂量均注明。C. azenosertib按指定剂量和时间表治疗携带OVCAR3肿瘤的NOD/SCID小鼠的TGI图。数据显示为平均电视± SEM。间歇给药方案：5：2、5天开、2天休；4：3、4天开、3天休；3：4、3天开、4天休。D.连续5天给药载体或azenosertib后，通过对各指示时间采集的OVCAR3肿瘤进行IHC分析测定γ H2AX水平的图谱。Y轴显示H评分相对于载体的变化（由3名独立的病理学家评估）。E.在疗效研究结束时采集血浆和肿瘤样本进行PK分析。条形图显示了azenosertib在药物剂量治疗和时间表下的AUC（左Y轴）和Cmax（右Y轴）。Plasma Cmax由红钻注解。表1。临床前模型预测人暴露Azenosertib OVCAR3模型（NOD/SCID小鼠）给药（mg/kg）频率Cmax（ng/mL）小鼠AUC0-24（h*ng/ml）TGI（%）a肿瘤回归（%）b预测人类AUC（h*ng/ml）c 60 QD，连续3,71321，14771.9 NA 9,86780 QD,5：24,73329，12487.8 NA 13,63190 QD,4：35,67336，87096.1 NA 17,25690 QD,5：26,38043，72699.8 NA 20,465100 QD,3：45,08741，90294.4 NA 19,611100 QD,4：36,48043，934101.6 16.320,56 1100 QD，5：26,08343，963103.83 7.720,576 A-427型号（NOD/SCID小鼠）给药（mg/kg）频率Cmax（ng/mL）小鼠AUC0-24（h*ng/ml）TGI（%）a肿瘤回归（%）b预测人类AUC（h*ng/ml）c 20 QD，连续1,1673，30116 NA 1,55740 QD，连续1,99714，24675 NA 6,71980 QD，连续5,10023，5591337111,112 ATGI =（1-[ TD – T0 ]/[ CD – C0 ]）× 100%。b肿瘤回归=（1-[ TD/T0 ]）× 100%；t0和td，治疗开始或结束时的平均TV。c通过azenosertib的血浆蛋白结合率进行调整，人的游离分数为34.4%，小鼠的游离分数为16.1%。图7。Azenosertib诱导持续的肿瘤生长抑制，治疗停止后耐受性良好020406080100120140060012001800240030003600天治疗后治疗3360mg3360mg2400mg3100mg020406080100120140-20-10 01020天治疗后M EA n TV ± S EM（m m 3）M EA n ↓ BW丨± S EM（m m m 3）载体40mg/kg BID 80mg/kg QD,4：3）× 1 +（100mg/kg QD，4：3）× 5（120mg/kg QD,5：2）× 1 +（100mg/kg QD,5：2）× 5 A B A。NOD/SCID小鼠皮下接种A-427细胞。当电视均值达到~200mm3（n = 10/组）时， 载体和azenosertib按指示剂量和时间表给药42天。在研究的剩余时间里，对动物进行了肿瘤生长关闭治疗的监测。接近每条曲线的数字表示治疗期间的总累积剂量。B.不同治疗组的平均体重变化。所有治疗均具有良好的耐受性（β BW ≤ 15%）。数据显示为平均电视或体重变化± SEM。图8。Azenosertib单药治疗在实体瘤患者中表现出抗肿瘤活性Azenosertib治疗前患者信息63-yo男性转移性结直肠癌61-yo男性转移性NSCLC 50-yo女性子宫平滑肌肉瘤癌51-yo男性肾癌72-yo女性宫颈癌BTR（-51 %）BTR（-49 %）BTR（-48 %）BTR（-68 %）BTR（-35 %）后反应数据来源于ZN-c3-001，首次人体1期临床试验（NCT04158336）。结果背景•癌细胞的高增殖率在DNA复制和有丝分裂过程中诱导显着应激，导致DNA损伤和基因组不稳定性增加•复制应激可由癌基因激活、代谢营养素或脱氧核苷酸池不足以及DDR或细胞周期检查点缺陷引起。如果癌细胞无法对DNA损伤做出充分反应——通过控制细胞周期进展或修复DNA损伤——就会发生基因组不稳定和异常的积累1-4 •靶向疗法通过靶向WEE1等细胞周期检查点的关键调节因子，利用DNA复制应激和基因组不稳定性在癌细胞中产生的脆弱性。这种方法有望治疗各种癌症类型5 • WEE1检查点激酶通过抑制CDK1和CDK2在DNA损伤反应中发挥关键作用，导致细胞周期停滞在G1/S和G2/M检查点，以便在有丝分裂前修复DNA损伤和适当完成DNA复制6 •使用azenosertib等选择性抑制剂抑制WEE1激酶显示出前景，特别是在G1/S检查点受损的癌症中，因为它可能导致有丝分裂灾难和凋亡7 •靶向检查点激酶抑制剂的临床开发面临挑战，尤其是血液学毒性。优化给药方案对于开发耐受性良好的临床有效疗法至关重要5,8，9图1。Azenosertib G2 M G1 S WEE1 G1/S检查点G2/M检查点WEE1的作用机制cyclin CDK cyclin丨CDK 丨CDK azenosertib Azenosertib DNA损伤增加并积累正常细胞周期CDK及其周期蛋白结合伙伴促进细胞周期的进展1 WEE1：DNA损伤期间基因组完整性的守护者，WEE1激酶磷酸化并使CDK/周期蛋白失活以阻止细胞周期并允许修复2 DNA损伤在癌症中DNA损伤和检查点调节因子的丧失是癌症发展和进展的关键因素3 Azenosertib作用机制Azenosertib抑制WEE1使CDK/周期蛋白失活；DNA受损的细胞继续经历细胞周期4以DNA损伤被迫复制的癌细胞死亡细胞经历有丝分裂巨灾和死亡5结论• WEE1在调节细胞周期检查点方面发挥核心作用，不局限于特定的癌症适应症。我们的数据表明，抑制WEE1会促进过早进入有丝分裂，诱导DNA损伤，并导致有丝分裂灾难和细胞死亡，在各种癌症类型中提供有效的抗肿瘤活性• WEE1抑制剂Azenosertib在妇科恶性肿瘤以外的一系列癌症中显示出临床前活性，包括结直肠癌、NSCLC、胰腺、前列腺和软组织肉瘤•该研究确定了WEE1抑制功效的潜在预测生物标志物（例如LKB1、mTOR或p27的表达），这可能有助于选择最有可能对治疗产生反应的患者• Azenosertib在细胞测定中不会显着抑制PLK1，减少对脱靶毒性和血液学副作用的担忧•我们的数据表明，间歇性给药方案（例如5：2）可提高药物耐受性和疗效，同时最大限度地降低毒性•在ZN-c3-001研究（NCT04158336）a中，Azenosertib在经过大量预处理的晚期实体瘤患者中显示出有希望的疗效•正在进行的研究旨在改进生物标志物策略，并将WEE1抑制与其他疗法相结合，以潜在地改善临床结果aStudy details在Zentalis公司介绍（2025年1月29日）中概述并在Zentalis管道网站上更新。参考文献1。Kotsantis P，et al. Cancer Discov。2018;8(5):537‑555.2.Visconti R，et al. J exp Clin Cancer Res.2016；35（1）：153。3. di Ror à AGL，et al. J Hematol Oncol。2017;10(1):77.4.Gaillard H，et al. Nat Rev Cancer。2015;15(5):276‑289.5. da Costa AABA，et al. Nat Rev Drug Discov。2023;22(1):38‑58.6. di Ror à AGL，et al. J Hematol Oncol。2020;13(1):126.7.孟X， et al. Front Med（洛桑）。2021;8:737951.8.Jiang K，et al. med drug discov。2024;22:100185.9.Ngoi NYL等Nat Rev Clin Oncol。2024;21(4):278‑293.10.Huang PQ，et al. J Med Chem。2021;64(17):13004‑13024.致谢本研究由Zentalis Pharmaceuticals, Inc.赞助。本款海报的编辑支持由Second City Science，LLC提供。有关本研究的更多信息，请访问www.zentalis.com简称3：4,3天前，4天休息；4：3,4天前，3天休息；5：2；5天前，2天休息；ABL1，酪氨酸蛋白激酶；AUC，曲线下面积；AUC0-24，AUC过去24小时；BID，每天两次；BrCA，乳腺癌；BRET，生物发光共振能量转移；BTR，最佳肿瘤反应；c，连续；CDK，细胞周期蛋白依赖性激酶；Cmax，最大血清浓度；丨CTG，Celltiter-Glo；β BW，体重变化；DDR，DNA损伤反应；DMSO，二甲基亚砜；EdU，荧光共振能量转移；G1/S，GAP1/合成；G2/M，GAP2/有丝分裂；GSK3，糖原合成酶激酶3；h，hour；γ H2AX，磷酸组蛋白H2AX；HGSOC，高级别浆液性卵巢癌；i，间歇性；IC50，半最大抑制浓度；IHC，免疫组化；JAK3，Janus激酶3；JESS，Jess自动化蛋白质印迹系统；LCK，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶；LKB1，肝激酶1；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点；mut，突变；NA，不适用；NOD/SCID，非肥胖型糖尿病/重症磷酸检查点激酶1（丝氨酸345）；PS10-HH3，磷酸组蛋白H3（丝氨酸10）；QD，每日1次；SCLC，小细胞肺癌；STK11，丝氨酸/苏氨酸激酶11；TCTP，翻译控制的肿瘤蛋白；TGI，肿瘤生长抑制；TV，肿瘤体积；wt，野生型；yo，岁。发表于：美国癌症研究协会（AACR），2025年4月25日-30日，美国伊利诺伊州芝加哥海报# 4208 Azenosertib是一种有效的选择性WEE1激酶抑制剂，在一系列实体瘤中具有广泛的抗肿瘤活性Wen Liu1、Jianhui Ma1、Jiali Li1、Daehwan Kim1、Sangyub Kim1、Alexandra Levy1、Kimberly Blackwell1、Alejandro Recio-Boiles2、Jennifer M. Segar2、Shirai Sen3、Deborah Doroshow4、Danielle Jandial1、Olivier Harismendy1、Stephan K. Grant1、Ahmed A. Samatar1、Mark R. Lackner1、Kimberlee M. Fischer1 1Zentalis美国；3NEXT Oncology，美国德克萨斯州达拉斯；4Thoracic Oncology，Early Phase Trials Unit，Mount Sinai，New York，NY，USA。激酶Adavosertib Azenosertib IC50（nM）ratioa IC50（nM）ratioa PLK1 3122760 LCK 4716447112 JAK3 12742618155 FGR 9833880220 ABL1 187621770443 a ratio = kinase（IC50）/WEE1（IC50）KURAMOCHI MDA-MB丨231 NCI-H1048 OVCAR3 γ H2Ax阳性细胞百分比处理DMSO 1.0 1.0 1.3 2.8 Azenosertib 9.8 18.1 18.7 15 γ H2Ax阳性细胞跨细胞周期阶段分布（azenosertib处理），% G1 27.58.84.29.4 Edu – S 35.04 3.84 1.155.7 Edu + S 11.21 2.6 16.85.6 G2/M 26.23 4.73 8.02 9.3 G2/M细胞按PHH3和γ H2AX状态分布（azenosertib处理），% PHH3 – γ H2AX – 83.16 7.85 8.86 4.0 PHH3 – γ H2AX + 3.28.5 10.9 4.1 PHH3 + γ H2AX – 3.84.025.2 15.5 PHH3 + γ H2AX + 9.9 19.75.1 16.3 附件 99.3